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基础微生物学课件46_图文


三、转导(transduction)

1.转导及其发现
J.Lederberg等(1952)在Salmonella typhimurium(鼠 伤寒沙门氏菌)中发现的。

Try-his+ A
[-]

Try+hisB
混合培养
[-] [-]

Try+his+

TryA-his+

Try+hisB

[-]

[-]

Try+his+

定义:以温和噬菌体为媒介,将供体细胞的DNA 片段携带到受体细胞中,通过交换与整合,从而 使后者获得前者部分遗传性状的现象,称为转导。 获得新遗传性状的受体细胞,称转导子。

2.转导的种类

转导

普遍转导

完全普遍转导 流产普遍转导

局限转导

低频转导 高频转导

(1) 普遍性转导(generalized transduction)
定义:通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包” 而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象,称为普遍性转 导。
1.1完全(普遍性)转导:complete transduction。1952年
发现,在Salmonella typhimurium中存在转导现象。在它的 完全普遍性转导实验中:
以其野生型菌株作为供体菌 营养缺陷型菌株作为受体菌 P22噬菌体作为转导媒介,对供体菌是烈性噬菌体,对受体菌是温和噬
菌体

过程:

裂解
供体菌

正常噬菌体 + 完全缺陷噬菌体

少量裂解物 + 大量受体菌

遗传稳定的转导子

完全普遍转导

(1) 普遍性转导(generalized transduction)
过程: P22在供体菌内增殖时,宿主的核染色体组断裂,待噬 菌体成熟与包装之际,极少数(10 – 6 ~10 – 8)噬菌体 的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA 片段误包入其中,形成了一个完全不含噬菌体自身 DNA的缺陷噬菌体。 供体菌裂解时,如把少量裂解物与大量受体菌群体相混, 使其感染复数(m.o.i)<1,这种完全缺陷噬菌体就会 将这一外源DNA片段导入受体细胞内。 在这种情况下,由于一个受体细胞只感染了一个完全缺 陷噬菌体,故受体细胞不会发生往常的溶原化,也不 显示其免疫性,更不会裂解和产生正常的噬菌体;而 由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上 的同源区段配对,在通过双交换而整合到受体菌染色 体组中,所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。

感染复数(m.o.i,multiplicity of infection):
感染复数——由于每一宿主细胞表面的特异性受体有限, 因此所能吸附的噬菌体数目也有一个限量。每一敏感细胞 所能吸附的噬菌体的数量,m.o.i一般很大,可达250~360。
由于超m.o.i的外源噬菌体吸附而引起的、不能产生子代噬 菌体的裂解,称为自外裂解(lysis from without)。

噬菌体裂解第一个宿主时可能有三种情况: 1)包入的完全是噬菌体的DNA(正常噬菌体) 2)包入的完全是细菌DNA(完全缺陷噬菌体) 3)部分带有噬菌体基因的DNA(部分缺陷噬菌体) 转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。
噬菌体裂解第一个宿主

一个稳定的转导子的形成
1. 第一次交换 2. 第二次交换 3. 交换完成,外源DNA掺入染色体组中

?1.2流产普遍性转导(abortive transduction)
概念:受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配 对、交换和整合,也不迅速消失,而只是进行转录和转译 (性状表达),这种现象就称为流产转导。
现象:发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后,只能将这段 外源DNA分配给一个子细胞,而另一子细胞仅获得供体基因 的产物——酶,在表型上表现出轻微的供体菌特征,每经过 一次分裂,就受到一次稀释,
所以,能在选 择性培养基平 板上形成微小 菌落就是流产 转导的特点。

2. 局限性转导
定义:通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中,并获得表达的转导现 象。
特点:
●噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体
●只能转导供体菌的个别特定基因(一般为噬菌体整合 位点两侧的基因)
●该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带
缺陷噬菌体使由于其在形成过程中所发生的低频率(约 10 – 5)“误切”,或由于双重溶源菌的裂解而形成 (约形成50%缺陷噬菌体)
分类:低频转导与高频转导

转导的过程
?温和噬菌体感染受体菌后,其DNA会开环,以线状形式整合到宿主染色体的特 定位点上,从而使宿主细胞发生溶源化,并获得对相同温和噬菌体的免疫性。
?该溶源菌被诱导裂解时,有极 少数(~ 10 – 5)的前噬菌体 (prophage)发生不正常切离 (abnormal excesion),其结果 会将插入位点两侧之一的少数 宿主基因(如E.coli?前噬菌体的 两侧分别为发酵半乳糖的gal基 因或合成生物素的bio基因)连 接到噬菌体DNA上(而噬菌体 也将相应的一段DNA遗留在宿 主的染色体组上),通过衣壳 的“误包”,就形成了一种特 殊的噬菌体——缺陷噬菌体 (defective phage)。它们没有 将宿主溶源化的能力,而是使 宿主成为一个局限转导子,对? 噬菌体没有免疫性。

2.1低频转导(LFT,low frequency transduction)
一般的转导现象中,从宿主染色体上切离时发生不 正常切离的频率极低,故这种裂解物中的部分缺 陷噬菌体的比例是极低的(10 – 4 ~ 10 – 6)。把这 种裂解物称为LFT(低频转导)裂解物 。
用LFT裂解物以低 m. o. i(感染复数)感染宿主, 就可获得极少量的局限转导子,即低频转导。

高频转导和低频转导图解
E.coli K12 (??)gal+(供体菌)
U.V.
? (大量) + ?dgal+(10-5)

E.coliK12Sgal-(受体菌)

低频转导

E.coliK12Sgal-/ ? dgal+ E.coliK12Sgal-/ ? dgal+/ ?

(双重容源转导子)

E.coliK12Sgal-/ ? dgal+/ ?(双重容源菌供体)

U.V.
?(50%) + ?dgal+(50%)

E.coliK12Sgal-(受体菌) 高频转导E.coliK12Sgal-/ ? dgal+(转导子)

双重容源菌 【E.coliK12(??/??dg)】
U.V. ①转导噬菌体( ?dg) + ②辅助噬菌体( ? )

转导子菌落

噬菌斑



2.2高频转导(HFT,high frequency transduction)
当用LFT裂解物以高m. o. i 感染E. coli gal–(不发酵半乳糖的营 养缺陷型)菌株时,凡是感染有λdgal噬菌体任一细胞,几乎都 同时感染有正常的 λ 噬菌体。这时λ 与λdgal同时整合在一个受 体菌的核染色体组上,从而使它成为一个双重溶源菌 (double lysogen)。当双重溶源菌被紫外线等诱导时,其中 的正常λ 噬菌体的基因可补偿λdgal缺失的部分基因功能,因而 两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以在双重溶源菌中的 正常λ 噬菌体被称为助体(或辅助)噬菌体(helper phage)。
双重溶源菌的裂解物中含有等量的λ 和λdgal粒子,称为HFT(高 频转导)裂解物。
用HFT裂解物以低 m. o. I 感染另一个E. coli gal–(不发酵半乳糖 的营养缺陷型)受体菌,就可以高频率地把它转化为能发酵 半乳糖的E. coli gal+ 转导子。是为高频转导

普遍性转导和局限性转导的比较

比较项目

普遍性转导

局限性转导

供体染色体或染色 供体染色体上与原噬菌体紧 转导的基因 体外的任何基因 密连锁的少数几个个别基因

噬菌体寄生 不结合在寄主染色 结合在寄主染色体特定位置

的位置

体特定位置上



获得转导噬 通过敏感菌的裂解 菌体的方法 或容源菌的诱导 紫外线诱导容源菌

一般稳定,非溶原 一般不稳定,呈缺陷溶原性

性(不表现出任何 (对同源噬菌体具有免疫性,

转导子的区 噬菌体的性状,包 但不表现出其它噬菌体的性



括免疫性)

状)

3.溶源转变
概念:当温和噬菌体感染宿主而使其发生溶源化时,因噬菌体的基因整合到宿 主的核基因组上,而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象,称为溶源 转变。
性质:表面上与转导相似,而本质上不同于转导。 区别:
当宿主丧失其原噬菌体时,通过溶源转变而获得的新性状也随之消失 温和噬菌体不携带来自供体菌的外源基因,是噬菌体自身基因使宿主获得
新性状 温和噬菌体使完整的,不是缺陷的 获得新性状的是溶源化的宿主细胞,不是转导子 典型实例: Corynebacterium diphtheriae(白喉棒杆菌):白喉毒素/?温和噬菌体 Clostridium botulinum(肉毒梭菌):C型或D型肉毒毒素 Salmonella anatum(鸭沙门氏菌):细胞表面多糖/E15噬菌体 Streptomyces erythreus(红霉素链霉菌):合霉素合成和气生菌丝形成/P4
温和噬菌体

(四)原生质体融合——protoplast fusion
概念:通过人为方法,使遗传性状不同的两细胞的原生质体 发生融合,并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状 的遗传性稳定的融合子(fusant)的过程,称为原生质体 融合。
适用范围:各种生物细胞都能进行原生质体融合,包括各种 原核生物、真核微生物以及高等动植物和人体的不同细胞。
意义:70年代后发展的一种育种新技术,继转化、转导和接 合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。原生质体融合 不仅能在不同菌株或种间进行,还能做到属间、科间甚至 更远缘的微生物或高等生物细胞间的融合。
发展点:有关原生质体融合的遗传机制,尚未研究清楚,目 前还在探索中。

?原生质体融合的优点: 可以提高重组率 双亲可以少带标记或不带标记 可进行多亲本融合 有利于不同种间、属间微生物的杂交 通过原生质体融合提高产量

原生质体融合的主要步骤:
选择亲株 → →制备原生质体→→原生质体融合 → →原生质体 再生 → → 筛选优良性状的融合 重组子

二、真核微生物的基因重组
主要方式:
有性杂交 准性杂交 原生质体融合(略) 转化(略)

(一)有性杂交
一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重 组,并产生新遗传型后代的过程。 凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌,原则上 都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性 杂交方法进行育种。

酵母菌的有性杂交育种
(一)酵母菌的生活史(复习)

(二)酵母菌有性杂交技术

酵母菌有性杂交程序一般为:

亲本的单倍化

↓ 有性杂交

↓ 杂交后代的检出

↓ 筛选优良性状个体

酵母菌有性杂交的方法:
1. 亲本的单倍化 1) 杂交亲本单倍体细胞的分离 A. 子囊孢子的形成 a. 形成子囊的条件 b. 一般方法 B. 单倍体子囊孢子的分离 a. 显微操作器分离单倍体子囊孢子法 b. 酶法 c. 机械研磨法 C. 单倍体菌株的确定 a. 单倍体细胞与二倍体细胞在形态方面的区别 b. 生孢子能力的测定 c. 单倍体细胞结合型的确定 2) 杂交亲本单倍体细胞遗传标记的制作

1. 可口可乐 2. 酵母菌有性杂交
1. 孢子杂交法 2. 群体交配法 3. 单倍体细胞杂交法 3. 杂交后代的检出 4. 筛选优良性状个体

S. Cerevisiae 的双倍体和单倍体细胞的比较

项目 细胞 菌落 液体培养 在产孢子培养基上

双倍体 大,椭圆形 大,形态均一 繁殖快,细胞较分散 形成子囊及子囊孢子
子囊孢子发芽

单倍体 小,球形 小,形态变化较多 繁殖较慢,细胞常聚集成团 不形成子囊
接合

自或 然人
破工 壁破 壁

减数分裂

(二)准性生殖(parasexual hybridization)
定义和意义:
类似于有性生殖但更原始的生殖方式,是通过同一物 种两个不同菌株的体细胞发生融合,不经过减数分裂 而导致低频率基因重组并产生重组子。 为半知菌育种提供了一个重要手段。
存在范围:常见于一些真菌尤其是半知菌中 准性生殖的过程:

准性生殖的过程:
①菌丝联结 ②异核体形成(质配) ③核配形成杂合二倍体 ④体细胞交换和单倍体 化。

异核体:同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。
同核体:同一菌丝中只有一种核。
异核体的特点:
1)具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体; 2)具有野生型性状,可在基本培养基上生长 ;
(基因互补功能) 3)大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基
上生长;如能生长,则为异核体、或为杂合 二倍体(重组子)。

体细胞交换和单倍体化
杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中, 能发生体细胞染色体间的交换、分离(单倍体化)而产生具 有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。

A

B

(同核体)

A+B

(异核体)

AB

AB (杂合二倍体)

AB

AB AB

单倍体杂合子

准性生殖与有性生殖的比较

项目

准性生殖

有性生殖

参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞

独立生活的异核体阶段





接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同

与单倍体明显不同

双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂

通过减数分裂

接合发生的几率 偶然发现,几率低

正常出现,几率高

准性杂交:
选择亲本:以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本
强制异合:将两菌亲株的分生孢子(106~107)混合涂[-]平板, 并做各单亲本对照, [-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二 倍体
移单菌落:纯化菌落,并将纯化后的菌落移入[-]斜面 验稳定性:在[-]夹层平板上培养后,再倒上一层[+],再培养 后若出现大量新菌落,说明是不稳定的异核体,反之是杂合 二倍体
促进变异:用诱变剂进行处理,以促进染色体发生交换、染 色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等,使 分离后的子代提高增加新性状的可能
筛选:

Penicillum urticae 的准性杂交步骤



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